Hi ha gairebé totes les empreses que van vendre elenzim bromelina en polses barreja amb papaïna. És difícil purificar la bromelina fins a 5000GDU/g. però és molt fàcil purificar la papaïna fins a 1000,000GDU/g. fins i tot fins a 2000.000 GDU/g. però les funcions de la bromelina són diferents de la papaïna. el color, l'olor, la solubilitat en aigua i el contrast de gust amb el producte fals i el producte real. Són la diferència que la pols de l'enzim bromelina adequat és gris, inodora, insípida i insoluble en aigua.
Però la bromelina falsa té les següents característiques:
● És de color groc clar, aromàtic i suau dolç, i soluble en aigua. És la característica de la papaïna.
● S'utilitza per reduir la inflamació i alleujar el dolor. però gairebé no hi ha aquestes funcions a la papaïna.
● S'utilitza només com a suplement dietètic, no com a additiu alimentari, però de fet pot ser de grau farmacèutic. Però la papaïna només s'utilitza com a pols de tendre carn i cosmètics.
Hem provat la bromelina segons els mètodes SDS-PAGE gel i GELATIN DIGESTION UNIT ANALÍTIC i HPLC, hi ha menys molècules diana en el mètode de gel SDS-PAGE per a producte fals.
A continuació es mostren els resultats de l'electroforesi de la pàgina SDS
La taca de l'anterior mostra que només el producte adequat té la mateixa taca al lloc correcte de la imatge, però el producte fals té petites taques, això significa que el pes molecular és gairebé visible.
El pes molecular de la bromelina és d'uns 33000, però el pes molecular de la papaïna és de 21000. I el cromatograma HPLC:
Veureu que només l'extracte adequat conté els pesos moleculars adequats de bromelina i és detectable per HPLC.
Però si només hem provat mitjançant el mètode analític de la unitat de digestió de gelatina (GDU), vegeu l'annex II. Tant el producte correcte com el fals tenen els mateixos resultats que a continuació:
La tija de la pinya és molt barata i la taxa de la tija a la bromelina és molt baixa, hi ha una mica de contaminació en el procés de fabricació.
Gairebé totes les fàbriques de pols d'enzims de bromelina són a prop. Utilitzen tija fresca. És impossible enviar la tija a llarga distància. La matèria primera s'ha de manipular tan aviat com sigui possible quan es recull del camp o s'ha d'emmagatzemar en un ambient de baixa temperatura (4-8 grau) per evitar la degradació de les proteïnes. A la vida real, el fabricant en realitat no pot complir cap de les dues condicions anteriors a causa de massa pinyes de tija. El mètode raonable és un equilibri entre el temps de manipulació i la pèrdua d'activitat proteica. En general, la fabricació de les matèries primeres brutes a la temporada de collita de la pinya i emmagatzemar les matèries primeres brutes en un entorn de baixa temperatura (4-8 grau).
Estem fent algunes proves sobre l'electroforesi de la pàgina SDS. En teoria, podem augmentar-la a 10,000 o 20,000, però serà molt car. 5000GDU/g i fer-lo estable potser en un suport malto/microencapsulat o alguna cosa més extracció/purificació de grau orgànic.
Annex I
● Mètode 5 Electroforesi en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE)
SDS-PAGE és un mètode d'electroforesi en gel de poliacrilamida desnaturalitzada. El principi de separació de proteïnes en aquest mètode es basa en el fet que la majoria de proteïnes es poden combinar amb el tensioactiu aniònic dodecil sulfat de sodi (SDS) en una proporció de pes per formar un complex.
La càrrega negativa que porten les molècules de proteïnes supera amb escreix la càrrega neta de les molècules de proteïnes naturals, eliminant l'efecte de càrrega de diferents molècules de proteïnes i separant les proteïnes segons la seva mida molecular.
Aquest mètode s'utilitza per a la identificació qualitativa, el control de puresa i impuresa i la determinació quantitativa de proteïnes.
1 Dispositiu instrumental
Font d'alimentació de tensió constant o de corrent constant, dipòsit d'electroforesi de placa vertical i motlle de fabricació d'adhesius.
2. Reactius
(1) Aigua.
(2) Tampó de gel de separació (4x, solució A) Tampó d'àcid clorhídric trihidroximetil aminometà 1,5 mol/L. Pesar 18,15 g de trihidroximetil aminometà i dissoldre'l amb una quantitat adequada d'aigua. Ajusteu el valor de pH a 88 amb àcid clorhídric i diluïu a 100 ml amb aigua.
(3) Pesar 58,0g d'acrilamida i 20 g de N,N'-metilenbisacrilamida en una solució d'acrilamida al 30% (solució B), dissoldre's en aigua tèbia i diluir a 200 ml, filtrar amb paper de filtre (emmagatzemat en fosc).
(4) Peseu 10 g de dodecil sulfat de sodi en una solució SDS al 10 per cent (solució C), dissoleu-lo en aigua i diluïu-lo a 100 ml.
(5) Reactiu de comercialització de solució de tetrametiletilendiamina (TEMED, solució D).
Solució de persulfat d'amoni al 10 per cent (solució E) Peseu 10 g de persulfat d'amoni, dissoleu-los en aigua i diluïu-los a 100 ml. Es recomana preparar-lo abans d'utilitzar-lo o emmagatzemar-lo per separat a -20 grau durant 2 setmanes.
(7) Tampó de goma concentrat (4 ×, solució F) 0.5mol/L Trihidroximetilaminometà Tampó d'àcid clorhídric, peseu 6,05 g de Trihidroximetilaminometà, afegiu una quantitat adequada d'aigua per dissoldre, ajusteu el valor de pH a 6,8 amb clorhídric àcid, i diluir amb aigua a 100 ml.
(8) Tampó d'elèctrodes (10 ×) Peseu 30 g de trimetilaminometà, 144 g de glicina i 10 g de dodecil sulfat de sodi, dissoleu-los en aigua i diluïu-los a uns 800 ml. Ajusteu el valor de pH a 8.1-8.8 amb àcid clorhídric i diluïu-lo a 1000 ml amb aigua.
(9) Tampó de mostra no reduït (4 ×) Pesar 303 g de trimetilaminometà, 20 mg de blau de bromofenol i 8,0 g de dodecil sulfat de sodi, mesurar 40 ml de glicerol, dissoldre's en aigua i diluir fins a uns 80 ml. Ajusteu el pH a 68 amb àcid clorhídric i diluïu a 100 ml amb aigua.
(8) Tampó d'elèctrodes (10 ×) Pesar 30 g de trimetilaminometà, 144 g de glicina i 10 g de dodecil sulfat de sodi, dissoldre's en aigua i diluir fins a uns 800 ml. Ajusteu el valor de DH a 81-88 amb àcid clorhídric i diluïu-lo a 1000 ml amb aigua
(9) Tampó de mostra no reduït (4 ×) Peseu 3,03 g de trimetilaminometà, 20 mg de blau de bromofenol i 80 g de dodecil sulfat de sodi, mesureu 40 ml de glicerol, dissoleu-lo en aigua i diluïu-lo a uns 80 ml. Ajusteu el pH a 6,8 amb àcid clorhídric i diluïu a 100 ml amb aigua.
(10) Tampó de substància de prova reduïda (4 ×) Peseu 3,03 g de trimetilaminometà, 20 mg de blau de bromofenol i 80 g de dodecil sulfat de sodi, mesureu 40 ml de glicerol, dissoleu i diluïu amb aigua fins a uns 80 ml i afegiu-hi - 20ml de mercaptoetanol, ajustar el pH a 6,8 amb àcid clorhídric, diluir amb aigua a 100 ml (o 3,03 g de trimetilaminometà, 20 mg de blau de bromofenol, 8,0 g de dodecil sulfat de sodi, mesurar 40 ml de glicerol i dissoldre en aigua). a 80 ml, ajustar el pH a 6,8 amb àcid clorhídric, diluir amb aigua a 100 ml i, abans d'utilitzar, afegir ditiotreitol a 100 mmol/L).
● Annex II
Unitat de digestió de gelatina Mètode analític (GDU)
A. Propòsit: aquest procediment s'utilitza per determinar l'activitat proteolítica de la pols d'enzims de bromelina.
B. Equipament:
1. pHmetre
2. Bany d'aigua a temperatura constant a 45,0 grau ± 0,1 grau
3. Balanç analític
4. Matrassos aforats
5. Pipetes volumètriques
6. Temporitzador
7. Bureta digital (precisió de 0,1 ml)
8. Campana extractora
9. Pipetes automàtiques
C. Precaucions de seguretat:
Aquesta prova s'ha de fer a la campana.
1. Utilitzar pràctiques estàndard de seguretat de laboratori.
2. Formaldehid: Preparar i conservar en una campana extractora en tot moment. Carcinogen i teratogen conegut.
3. Peròxid: oxidant fort
D. Reactius i preparacions de reactius:
1. Aigua destil·lada: aproximadament 500 ml: ajustar a un pH de 4,5 amb HCl 0,1 N.
2. Substrat de gelatina:
a. Dissoleu 25 grams de gelatina (Mikrobiologie. 1.04070) en 375 ml d'aigua calenta, porteu-ho a ebullició. Refredar a 45 graus.
b. Ajusteu el pH a 4,5 amb 0,1 N HCl i diluïu-ho a 500 ml d'aigua destil·lada pH 4,5.
c. Mantingueu el substrat de gelatina a 45 graus.
3. Solució tampó:
a. Afegiu lentament 15 g de NaCl a 40-50 ml d'aigua en un vas de precipitats de 150 ml i remeneu per dissoldre's.
b. Afegiu 0,570 ml d'àcid acètic.
c. Ajusteu el pH a 4,5 amb 0.2N HCL (el volum serà superior a 100 ml).
4. 3 per cent de peròxid d'hidrogen:
a. Pipeteu 2,5 ml de peròxid d'hidrogen al 30 per cent (solució de reserva) en un matràs aforat de 25 ml i diluïu-lo a volum amb aigua destil·lada de pH 4,5.
5. 37 per cent de formaldehid pH 9.0: a. Ajusteu un volum suficient (100 ml) de formaldehid a pH 9,0 amb NaOH 0,1 N (aproximadament 20 ml de formaldehid per mostra abans de l'ajust de pH).
Unitat de digestió de gelatina Mètode analític (GDU) - cont.
6. 0.10NaOH 0 N: (Comprat estandarditzat) a. Solució estoc: estandarditzada a 0,100 N
E. Procediment:
1. Preparació d'enzims:
a. Càlcul de la preparació d'enzims
Pes {{0}}/Activitat objectiu (aproximadament 0,05 g o 50 mg)
A. Pesar l'enzim amb precisió en un matràs aforat de 50 ml
B. Afegiu 8,3 ml de solució tampó.
b. Deixeu reposar 30 minuts a temperatura ambient.
C. Diluir a 50 ml amb aigua destil·lada de pH 4,5, afegir una petita barra d'agitació i remenar durant 10 a 15 minuts més.
2. Procediment enzimàtic:
a. Pipeteu 25 ml de substrat de gelatina a cadascun dels dos vas de precipitats de 100 ml que contenen barres d'agitació i poseu-los al bany maria a 45 graus durant 5 minuts, un per a la solució de prova i l'altre per a la solució en blanc.
b. Solució de prova:
1) Afegiu 1,0 ml de solució en pols d'enzims de bromelina al vas de precipitats designat per a la solució de prova, comenceu a cronometrar i agiteu.
2) Després d'exactament 20 minuts d'incubació a 45 graus, afegiu 0,1 ml de peròxid d'hidrogen al 3 per cent i agiteu-ho.
3) Incubar durant 5 minuts més.
4) Retirar el vas del bany maria i amb agitació constant introduir la sonda de pH.
5) Anoteu el pH després de 10 segons (pH inicial)
6) Ajustar a pH 6.0 amb 0,1 N NaOH. (Aproximadament 2-4 ml)
*Nota: quan ajusteu el pH a 6.0 aneu amb compte a pH 5,8; el pH augmenta lentament i les petites addicions de NaOH en aquest punt augmentaran significativament el pH.
7) Continuant amb l'agitació constant, afegiu 10 ml de formaldehid al 37% pH 9,0.
8) Anoteu el pH després de 10 segons i 1 minut.
9) Titular a pH 9.0 amb 0,1 N NaOH.
10) Anoteu el volum de valoració.
Aquest és el títol de prova, T. c.
Solució en blanc: la solució en blanc s'ha d'executar simultàniament amb la solució de prova. Això s'aconsegueix iniciant la determinació de la solució en blanc 12 minuts després d'iniciar la solució de prova. Això us dóna temps per completar l'assaig a la solució de prova abans d'haver de continuar amb la solució en blanc. 1) Afegiu 0,1 ml de peròxid d'hidrogen al 3 per cent al vas de precipitats designat per a la solució en blanc i remolí.
2) Després d'exactement 20 minuts d'incubació a 45 graus, afegiu 1,0 ml de solució de bromelina i agiteu.
3) Incubar durant 5 minuts més.
UNITAT DE DIGESTIÓ DE GELATINA MÈTODE ANALÍTIC (GDU) - cont.
4) Retirar el vas del bany maria i amb agitació constant introduir la sonda de pH.
5) Anoteu el pH després de 10 segons (pH inicial)
6) Ajustar a pH 6.0 amb 0,1 N NaOH. (Aproximadament 2-4 ml)*Vegeu la nota anterior.
7) Continuant amb l'agitació constant, afegiu 10 ml de formaldehid al 37% pH 9,0.
8) Anoteu el pH després de 10 segons i 1 minut.
9) Titular a pH 9.0 amb 0,1 N NaOH.
10) Anoteu el volum de valoració. Aquest és el títol en blanc, B.
F. Càlcul:
1. Definició: una unitat de digestió de gelatina és aquella quantitat d'enzim que alliberarà, després de 20 minuts de digestió a 45 graus, 1 mg de nitrogen amino d'una solució estàndard de gelatina a pH 4,5 o pH 5,5 (GDU pH 4,5 o pH 5,5).
GDU/g {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Pes (g) On: T {= Títol de prova (ml 0,1 N NaOH) B=Títol en blanc (ml 0,1 N NaOH) N=Normalitat del NaOH estandarditzat (és a dir, 0,100) Pes (g)=Pes inicial de l'enzim
G. Paràmetres de prova:
1. Les preparacions enzimàtiques es dilueixen a una concentració d'aproximadament 0,001 g/ml (1 mg/ml) o per al concentrat en pols d'enzims de bromelina aproximadament 1-2 GDU/ml. Amb cada execució s'assaja un material de referència per garantir la precisió del mètode.
Guanjie proporciona bromelina en pols a granel, utilitzant el mètode de prova GDU. El nostre procés de producció funciona sota tallers estàndard CGMP, utilitzant tres línies de producció a dues fàbriques i dos laboratoris independents. Per a qualsevol consulta sobre els nostres productes, poseu-vos en contacte amb nosaltres ainfo@gybiotech.com.
